Guías de laboratorio
Cómo se fabrican, analizan, almacenan y preparan los péptidos para trabajo in vitro, y cómo evaluar la documentación que los acompaña.
Fundamentos
- ¿Qué es un péptido?
Un péptido es una cadena corta de aminoácidos unidos por enlaces amida. Esta guía explica cómo se construyen, nombran, modifican, fabrican y clasifican los péptidos, y en qué se diferencian de las proteínas.
- La liofilización explicada
La liofilización elimina el agua de una solución de péptido congelada por sublimación y produce un polvo seco y estable. Esta guía aborda la congelación, el secado primario y secundario, el aspecto de la torta, la humedad residual y la manipulación del material seco.
- Síntesis de péptidos en fase sólida
La síntesis de péptidos en fase sólida construye un péptido residuo a residuo sobre un soporte de resina. Esta guía aborda el método de Merrifield, las estrategias Fmoc y Boc, el acoplamiento y la escisión, y las impurezas que genera la síntesis.
- Referencia de aminoácidos para la investigación con péptidos
Una referencia de los 20 aminoácidos estándar, con sus códigos de tres letras y de una letra, la química de sus cadenas laterales y sus agrupaciones, además de los residuos no estándar que aparecen con más frecuencia en los péptidos de investigación, como Aib, norleucina, isómeros D, piroglutamato y ornitina.
- Nomenclatura y modificaciones de péptidos
Cómo se escriben las secuencias y modificaciones de péptidos: códigos de una y de tres letras, la convención N a C, grupos terminales como Ac- y -NH2, notación cíclica y de disulfuros, prefijos de residuos D, formas salinas y los nombres INCI utilizados para los péptidos cosméticos.
- Lipidación y extensión de la vida media
Los péptidos nativos se eliminan rápidamente de la circulación. Esta guía explica las principales estrategias utilizadas para prolongar su persistencia: cadenas laterales de ácidos grasos y unión a la albúmina, PEGilación, fusión a Fc y fusión a albúmina, y el enfoque Drug Affinity Complex.
- Péptidos cíclicos y enlaces disulfuro
La ciclación restringe la forma de un péptido y puede aumentar su estabilidad y su selectividad por el receptor. Esta guía compara los puentes disulfuro, los puentes de lactama y la ciclación cabeza-cola, con ejemplos como la oxitocina, PT-141, el melanotan II y la setmelanotida.
- D-aminoácidos y péptidos retro-inversos
Los D-aminoácidos son las imágenes especulares de las formas L naturales. Esta guía explica la quiralidad en los péptidos, por qué las sustituciones por residuos D resisten a las proteasas, cómo se diseñan los péptidos retro-inversos como FOXO4-DRI y cómo se analiza el contenido de residuos D.
- Cómo leer la investigación preclínica sobre péptidos
Gran parte de la investigación sobre péptidos proviene de estudios en células y animales. Esta guía explica los niveles de evidencia, por qué los hallazgos in vitro y en animales a menudo no se trasladan a las personas, por qué las comparaciones de dosis entre especies no son fiables y cómo la replicación y el sesgo de publicación configuran una literatura.
- Preparación magistral: 503A frente a 503B
En EE. UU., la preparación magistral en farmacia está regulada por las secciones 503A y 503B de la Ley Federal de Alimentos, Medicamentos y Cosméticos (Federal Food, Drug, and Cosmetic Act). Esta guía explica cada vía, las listas de sustancias farmacéuticas a granel, las categorías provisionales de la FDA, el papel del PCAC y en qué se diferencia la preparación magistral de la venta de productos solo para uso en investigación.
Calidad y análisis
- Cómo leer un certificado de análisis de péptidos
Un certificado de análisis resume las pruebas realizadas a un lote de péptido. Esta guía recorre cada sección de un COA típico, explica qué significan las cifras y señala las alertas que indican que no se puede confiar en el documento.
- Pureza frente a contenido neto de péptido
La pureza por HPLC y el contenido neto de péptido responden preguntas distintas sobre un polvo de péptido. Esta guía explica qué mide cada uno, cómo se determinan y cómo usarlos en conjunto al preparar soluciones de concentración conocida.
- HPLC y espectrometría de masas explicadas
La HPLC y la espectrometría de masas son los dos métodos analíticos fundamentales para péptidos. Esta guía explica cómo la HPLC de fase reversa separa los péptidos, cómo la espectrometría de masas ESI y MALDI confirma la identidad y cómo la LC-MS combina ambas.
- Pruebas de endotoxina para péptidos
Las endotoxinas son lipopolisacáridos de bacterias gramnegativas que pueden distorsionar los experimentos celulares y en animales. Esta guía aborda los métodos LAL de gel-coágulo, turbidimétrico y cromogénico, el factor C recombinante, las unidades de endotoxina y cómo interpretar los resultados.
- Contraiones: TFA frente a acetato
Los péptidos sintéticos se suministran como sales, con mayor frecuencia con contraiones de trifluoroacetato o acetato. Esta guía explica de dónde provienen los contraiones, cómo afectan el contenido neto de péptido y los experimentos, y cómo funciona el intercambio de sal.
- Contenido de cobre en GHK-Cu
GHK-Cu es un complejo del tripéptido glicil-histidil-lisina con cobre(II). Esta guía aborda la unión del cobre y la estequiometría, qué indica el color azul, cómo se mide el cobre por ICP-MS, ICP-OES y métodos colorimétricos, y por qué importa el cobre libre en los ensayos.
- Métodos de cuantificación de péptidos
Cómo se determina la cantidad de péptido en un polvo o una solución: pesaje gravimétrico, absorbancia UV a 280, 214 y 205 nm, análisis de aminoácidos, determinación de nitrógeno y RMN cuantitativa, y por qué los ensayos de proteínas BCA y Bradford no son fiables para péptidos cortos.
Manejo y almacenamiento
- Almacenamiento y estabilidad de péptidos
Los péptidos se degradan por oxidación, desamidación, formación de aspartimida, hidrólisis y agregación. Esta guía explica cada vía, qué secuencias corren más riesgo y las prácticas de laboratorio para almacenar el polvo liofilizado y las soluciones.
- Reconstitución para uso en laboratorio
Cómo disolver péptidos liofilizados para trabajo in vitro: predecir la solubilidad a partir de la carga y la hidrofobicidad, elegir entre agua estéril, agua bacteriostática, ácido acético diluido y DMSO, mezclar con suavidad, preparar alícuotas y calcular las concentraciones de las soluciones madre.
- Predecir la solubilidad de un péptido a partir de su secuencia
Cómo la carga neta, el punto isoeléctrico, la hidrofobicidad y la tendencia a formar estructura secundaria predicen si un péptido se disolverá, y cómo usar esas estimaciones para elegir disolventes y pH para soluciones madre in vitro.
- Agregación de péptidos
Los péptidos pueden autoasociarse en oligómeros, precipitados amorfos, geles o fibrillas de tipo amiloide. Esta guía explica qué impulsa la agregación, cómo se detecta, cómo distorsiona los experimentos y las prácticas de laboratorio que la reducen.
- Filtración esterilizante de soluciones de péptidos
La filtración esterilizante a través de membranas de 0,22 µm elimina las bacterias de las soluciones de péptidos para el trabajo in vitro. Esta guía aborda las clasificaciones de tamaño de poro, los materiales de membrana como PES y PVDF, las pérdidas por adsorción, lo que la filtración no elimina y las buenas prácticas de laboratorio.