Pruebas de endotoxina para péptidos
Las endotoxinas son lipopolisacáridos de bacterias gramnegativas que pueden distorsionar los experimentos celulares y en animales. Esta guía aborda los métodos LAL de gel-coágulo, turbidimétrico y cromogénico, el factor C recombinante, las unidades de endotoxina y cómo interpretar los resultados.
Qué es la endotoxina
Endotoxina es el nombre común del lipopolisacárido (LPS), un componente principal de la membrana externa de las bacterias gramnegativas. Su porción lípido A es reconocida por el receptor inmunitario innato TLR4, y cantidades muy pequeñas pueden desencadenar una fuerte señalización inflamatoria en células inmunitarias y en animales. La endotoxina se libera cuando las bacterias mueren o se dividen y es muy termoestable, por lo que la esterilización no la elimina.
En la investigación con péptidos, la endotoxina importa porque puede producir efectos biológicos que se confunden con efectos del péptido. En ensayos con macrófagos, monocitos u otras células inmunitarias, la contaminación puede provocar por sí sola la liberación de citocinas. Un péptido del que se informa que modula la inflamación in vitro solo es interpretable si se ha medido la endotoxina y su nivel es bajo.
De dónde proviene la endotoxina
Los péptidos sintéticos no son producidos por bacterias, pero aun así pueden adquirir endotoxina del agua, los tampones, el material de vidrio, las columnas de cromatografía y la manipulación. Los péptidos expresados de forma recombinante en E. coli parten de una gran carga de endotoxina que debe eliminarse durante la purificación. La endotoxina no se elimina mediante filtración esterilizante de 0,22 µm, porque las moléculas individuales de LPS y los agregados pequeños atraviesan esos filtros.
Por lo tanto, la endotoxina es un atributo de calidad distinto de la esterilidad. Un material puede ser estéril, es decir, no contener organismos viables, y aun así portar endotoxina. A la inversa, un resultado bajo de endotoxina no dice nada sobre la contaminación microbiana viva; esta se evalúa mediante pruebas de carga biológica o de esterilidad.
Como la endotoxina se adhiere a las superficies y es difícil de destruir, los laboratorios que necesitan condiciones de baja endotoxina usan material de plástico y agua certificados libres de pirógenos, y despirogenan el material de vidrio con calor seco a alta temperatura en lugar de confiar en el autoclave. La endotoxina introducida desde estas fuentes durante la preparación de soluciones puede superar fácilmente la que aporta el propio péptido.
La prueba LAL y sus tres formatos
La prueba clásica utiliza lisado de amebocitos de Limulus (LAL), preparado a partir de las células sanguíneas del cangrejo herradura del Atlántico. La endotoxina activa el factor C del lisado, lo que desencadena una cascada enzimática que termina en la coagulación. Los métodos farmacopeicos describen tres formas de leer esta reacción.
- Gel-coágulo: la muestra y el lisado se incuban en un tubo, que se invierte para ver si se ha formado un gel firme. Es una prueba límite que da un resultado de aprobado o no aprobado a la sensibilidad declarada del lisado, o un resultado semicuantitativo cuando se realiza como serie de diluciones.
- Turbidimétrico cinético: el instrumento registra el aumento de turbidez a medida que se forma el coágulo; el tiempo hasta alcanzar un umbral se compara con una curva patrón para obtener un resultado cuantitativo.
- Cromogénico cinético o de punto final: un sustrato sintético libera un cromóforo amarillo (p-nitroanilina) al ser escindido por la enzima de la cascada; el desarrollo de color se lee y se compara con una curva patrón.
Factor C recombinante y otras alternativas
Los ensayos de factor C recombinante (rFC) utilizan una versión clonada de la primera enzima de la cascada junto con un sustrato fluorogénico. Como el rFC responde a la endotoxina solo a través del factor C, evita la vía alternativa del factor G presente en el LAL, que puede dar falsos positivos por betaglucanos derivados de hongos o de filtros de celulosa. El rFC también elimina la dependencia de la captura de cangrejos herradura.
Las farmacopeas reconocen cada vez más los reactivos recombinantes, aunque los requisitos de aceptación y validación difieren según la región y la aplicación. Otros enfoques incluyen los reactivos de cascada recombinante y, para detectar una gama más amplia de pirógenos, la prueba de activación de monocitos, que mide la liberación de citocinas en células monocíticas humanas.
Unidades y forma de informar los resultados
La endotoxina se informa en unidades de endotoxina (UE), una unidad de actividad biológica definida frente a una endotoxina patrón de referencia y no una masa de LPS. Para materiales sólidos, el resultado se expresa por miligramo, como UE/mg; para soluciones, en UE/mL. Un resultado informado con un signo de menor que delante de un valor significa que no se detectó endotoxina a la sensibilidad del método en la dilución analizada; el valor es un límite de detección, no una medición.
Un informe completo indica el método (gel-coágulo, turbidimétrico, cromogénico o rFC), la sensibilidad del lisado o el intervalo de la curva patrón, la dilución utilizada y el resultado de un control positivo de producto que demuestre que la muestra no inhibió la reacción. Sin el control de inhibición, un resultado bajo podría reflejar interferencia y no una muestra limpia.
Interferencias y dificultades propias de los péptidos
Los péptidos pueden interferir con los ensayos de endotoxina. Los péptidos catiónicos y anfipáticos, como muchos péptidos antimicrobianos, incluido LL-37, pueden unirse al LPS y enmascararlo, lo que produce resultados falsamente bajos. El pH extremo, los agentes quelantes, la alta concentración de sales y algunos disolventes pueden inhibir o potenciar la cascada enzimática. Los laboratorios lo resuelven diluyendo la muestra hasta una concentración sin interferencia dentro de la dilución máxima válida y realizando controles enriquecidos.
Los contraiones y el pH también importan. Un péptido disuelto como sal de TFA puede producir una solución ácida fuera del intervalo de trabajo del lisado, que debe ajustarse con un tampón libre de endotoxina antes del análisis. Use agua y material de laboratorio libres de endotoxina para preparar la muestra, ya que la contaminación introducida durante la preparación se informará como parte del resultado.
Uso práctico de los datos de endotoxina
No existe un único nivel aceptable de endotoxina para toda la investigación. El umbral pertinente depende del sistema experimental: los ensayos con células inmunitarias y el trabajo in vivo con animales son mucho más sensibles que muchos ensayos bioquímicos. Los investigadores suelen fijar una especificación interna para cada tipo de ensayo y verificarla para cada lote, en particular para péptidos estudiados en modelos de inflamación, como KPV o timosina α1.
Los resultados de endotoxina deben figurar en el certificado de análisis junto con la identidad y la pureza. Cuando faltan para un material destinado a trabajo con células o animales, es aconsejable un análisis independiente; consulte cómo leer un COA. Una vez preparada una solución, manipularla de forma aséptica y almacenar las alícuotas correctamente ayuda a prevenir contaminaciones posteriores, como se describe en reconstitución para uso en laboratorio.
Preguntas frecuentes
¿La filtración esterilizante elimina la endotoxina?
No. Un filtro de 0,22 µm elimina las bacterias pero no la endotoxina, porque las moléculas de lipopolisacárido y los agregados pequeños son mucho más pequeños que el tamaño de poro. La eliminación de endotoxina requiere métodos específicos, como la adsorción por intercambio iónico o por afinidad, la ultrafiltración en algunas condiciones, o evitar la contaminación desde el principio. La esterilidad y la endotoxina son pruebas distintas.
¿Cuál es la diferencia entre el LAL y el factor C recombinante?
El LAL es un lisado de células sanguíneas de cangrejo herradura que contiene una cascada enzimática completa. El factor C recombinante utiliza solo una versión clonada de la primera enzima de la cascada con un sustrato fluorescente. El rFC no se activa por betaglucanos a través de la vía del factor G y no depende de la captura de cangrejos, pero su aceptación para usos regulados específicos depende de los requisitos farmacopeicos de cada región.
¿Qué significa UE/mg?
UE es una unidad de endotoxina, una medida de actividad biológica estandarizada frente a una endotoxina de referencia. UE/mg expresa la actividad de endotoxina encontrada por miligramo del material sólido analizado. Como es una unidad de actividad, no puede convertirse directamente en una masa de lipopolisacárido sin hacer referencia al patrón específico utilizado.
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