Métodos de cuantificación de péptidos
Cómo se determina la cantidad de péptido en un polvo o una solución: pesaje gravimétrico, absorbancia UV a 280, 214 y 205 nm, análisis de aminoácidos, determinación de nitrógeno y RMN cuantitativa, y por qué los ensayos de proteínas BCA y Bradford no son fiables para péptidos cortos.
Por qué la cuantificación es más difícil de lo que parece
Pesar un polvo de péptido indica la masa de todo lo que hay en el vial, no la masa de péptido. Los péptidos liofilizados contienen contraiones, agua ligada y, a veces, disolvente residual, y son higroscópicos, por lo que su peso cambia al exponerse al aire. Los péptidos en solución también pueden perderse por adsorción a superficies o por agregación. En consecuencia, la concentración calculada a partir de una masa pesada y un volumen suele ser una sobrestimación.
Una cuantificación exacta importa siempre que se comparan resultados entre lotes, laboratorios o concentraciones, por ejemplo en experimentos de concentración-respuesta o estudios de unión. Los métodos que se describen a continuación difieren en exactitud, equipo necesario, consumo de muestra y tipo de secuencia a la que se adaptan. La relación entre pureza y contenido se explica en pureza frente a contenido neto de péptido.
Métodos gravimétricos
La cuantificación gravimétrica consiste en pesar el material en una balanza analítica o una microbalanza y dividir por el volumen de disolvente. Es sencilla y es el punto de partida habitual, pero su exactitud está limitada por la balanza a masas pequeñas, la electricidad estática de los polvos secos, la absorción de humedad durante el pesaje y, sobre todo, el contenido no peptídico del polvo.
Los resultados gravimétricos cobran sentido cuando se corrigen con un contenido neto de péptido medido. Las buenas prácticas incluyen dejar que los viales alcancen la temperatura ambiente en un desecador antes de abrirlos, pesar rápidamente, usar un dispositivo antiestático con liofilizados esponjosos y pesar suficiente material para que la incertidumbre de la balanza sea pequeña respecto del total. Disolver todo el contenido de un vial y basarse en un valor de contenido medido evita pesar repetidamente cantidades pequeñas.
Absorbancia UV a 280 nm
La absorbancia UV a 280 nm es la forma más rápida de medir la concentración de péptido en solución, pero solo para secuencias que contienen triptófano o tirosina. La concentración se calcula con la ley de Beer-Lambert usando un coeficiente de extinción molar estimado a partir del número de residuos de Trp y Tyr y, en pequeña medida, de cistinas. El analizador de secuencias puede proporcionar esta estimación a partir de la secuencia.
Los coeficientes de extinción calculados son aproximaciones, porque el entorno local desplaza la absorbancia de los aromáticos, y el error es proporcionalmente mayor en los péptidos con un solo residuo aromático. Las mediciones deben usar un blanco del mismo disolvente, cubetas de cuarzo o transparentes al UV o un instrumento de microvolumen adecuado, y soluciones libres de agregados que dispersen la luz. Los péptidos sin Trp ni Tyr, como BPC-157 o GHK-Cu, no pueden cuantificarse a 280 nm.
Absorbancia UV a 205 y 214 nm
El propio enlace peptídico absorbe intensamente en el UV lejano, por lo que las mediciones a 205 o 214 nm permiten cuantificar péptidos que carecen de residuos aromáticos. Se han publicado métodos que estiman los coeficientes de extinción a estas longitudes de onda a partir de las contribuciones del esqueleto y de las cadenas laterales de cada residuo. La sensibilidad es mucho mayor que a 280 nm.
La desventaja es la escasa selectividad. Muchos componentes de los tampones, como el acetato, el TFA, el formiato, el DMSO, algunos detergentes y el oxígeno disuelto, absorben intensamente por debajo de unos 220 nm, por lo que el disolvente debe elegirse con cuidado y el blanco debe ajustarse con precisión. Incluso una pequeña cantidad de una impureza que absorba en el UV puede distorsionar el resultado. Por lo tanto, la absorbancia en el UV lejano es más fiable con soluciones limpias en tampones transparentes, y es el mismo principio que se utiliza para la detección en HPLC; consulte HPLC y espectrometría de masas explicadas.
Análisis de aminoácidos y determinación de nitrógeno
El análisis de aminoácidos (AAA) se considera ampliamente el método de referencia para la cuantificación absoluta de péptidos. El péptido se hidroliza, por lo general en ácido clorhídrico caliente, hasta aminoácidos libres, que se separan y cuantifican frente a patrones, a menudo tras una derivatización. Las cantidades medidas de los residuos estables se comparan con la secuencia para calcular la cantidad de péptido. Algunos residuos se destruyen o transforman parcialmente durante la hidrólisis ácida, en particular el triptófano, la cisteína, y la asparagina y la glutamina, que se convierten en sus ácidos, por lo que los resultados fiables dependen de los residuos estables o de condiciones de hidrólisis especiales.
La determinación de nitrógeno es el otro enfoque principal. El análisis elemental por combustión, o la digestión de Kjeldahl, mide el nitrógeno total, que se convierte en masa de péptido usando la fracción de nitrógeno calculada a partir de la secuencia. Es exacto en materiales limpios, pero cuenta todo el nitrógeno, de modo que los contraiones nitrogenados, los tampones como las sales de amonio y los disolventes residuales como el DMF sesgan el resultado al alza. Tanto el AAA como los métodos de nitrógeno son las vías habituales para obtener el contenido neto de péptido de un certificado de análisis.
Ensayos colorimétricos de proteínas y sus límites
Los ensayos de proteínas diseñados para proteínas en muestras biológicas suelen ser poco fiables para péptidos cortos y deben usarse con precaución, si es que se usan, para cuantificarlos.
- Bradford (Coomassie): el colorante se une principalmente a la arginina, la lisina y los residuos aromáticos, y necesita un tamaño molecular mínimo, citado a menudo en torno a 3 kDa, para dar una respuesta estable. Los péptidos cortos responden débilmente o no responden, y la respuesta varía mucho según la composición.
- BCA: se basa en la reducción del cobre(II) por el esqueleto peptídico y por las cadenas laterales de Cys, Tyr y Trp. Los péptidos cortos responden, pero el rendimiento de color por miligramo difiere mucho entre secuencias, y los péptidos que contienen cobre, como GHK-Cu, o los agentes reductores interfieren directamente.
- Lowry: comparte muchas de las limitaciones del BCA y tiene interferencias adicionales.
- Fluorescamina u OPA: reaccionan con aminas primarias y pueden ser útiles para péptidos con extremos N-terminales libres o lisinas, pero quedan bloqueados por la acetilación N-terminal o el piroglutamato.
Elección del método
El método adecuado depende de la pregunta. Para la preparación rutinaria de soluciones madre, el pesaje con corrección por un contenido neto de péptido específico del lote suele ser suficiente. En péptidos con Trp o Tyr, la A280 ofrece una comprobación práctica de la solución realmente preparada. Para material de referencia o comparaciones cuantitativas críticas, el análisis de aminoácidos o la RMN cuantitativa con un patrón interno ofrecen los valores más defendibles.
Sea cual sea el método utilizado, debe registrarse junto con el resultado, y las soluciones que vayan a compararse directamente deben cuantificarse de la misma manera. Cuando es posible calibrar frente a un patrón de referencia del mismo péptido, se eliminan muchas incertidumbres dependientes de la secuencia. Los propios cálculos de concentración pueden hacerse con la calculadora de laboratorio.
Preguntas frecuentes
¿Puedo usar un ensayo de Bradford para medir un péptido corto?
En general, no de forma fiable. El colorante Coomassie necesita un tamaño molecular mínimo y residuos específicos para unirse, por lo que los péptidos cortos dan una respuesta débil y dependiente de la secuencia. Calibrar frente a un patrón de proteína como la BSA daría valores engañosos. La absorbancia UV, el análisis de aminoácidos o el pesaje con corrección por el contenido neto de péptido son más apropiados.
¿Cómo cuantifico un péptido que no tiene triptófano ni tirosina?
Entre las opciones figuran la absorbancia en el UV lejano a 205 o 214 nm en un tampón transparente, el análisis de aminoácidos, la determinación de nitrógeno, la RMN cuantitativa o el pesaje corregido por un contenido neto de péptido medido. Los ensayos fluorescentes reactivos con aminas pueden funcionar si el extremo N-terminal o las lisinas están libres. Cada método tiene interferencias que deben tenerse en cuenta.
¿Por qué se considera el análisis de aminoácidos el método de referencia?
Porque mide directamente los componentes del péptido frente a patrones de aminoácidos, con independencia de los contraiones, el agua o el disolvente presentes en la muestra. Con residuos estables y condiciones de hidrólisis apropiadas, da una cantidad absoluta de péptido, razón por la cual se utiliza habitualmente para determinar el contenido neto de péptido en los certificados de análisis.
Compuestos mencionados
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