Reconstitución para uso en laboratorio
Cómo disolver péptidos liofilizados para trabajo in vitro: predecir la solubilidad a partir de la carga y la hidrofobicidad, elegir entre agua estéril, agua bacteriostática, ácido acético diluido y DMSO, mezclar con suavidad, preparar alícuotas y calcular las concentraciones de las soluciones madre.
Alcance de esta guía
Esta guía trata la preparación de soluciones madre de péptidos para experimentos de laboratorio, como ensayos bioquímicos, cultivo celular y trabajo analítico. Aborda la selección del disolvente, la técnica de disolución, la preparación de alícuotas y los cálculos de concentración. No abarca, y no debe interpretarse como orientación para, la preparación de nada destinado a su administración a personas o animales.
El disolvente debe elegirse desde el principio teniendo en cuenta el experimento posterior. Un disolvente que disuelve fácilmente el péptido pero es incompatible con el ensayo, como una concentración alta de DMSO para células sensibles o un ácido sin tamponar para un ensayo enzimático, simplemente traslada el problema a un paso posterior.
Antes de disolver un vial completo, es una buena práctica probar la solubilidad con una pequeña porción del material, sobre todo en el caso de una secuencia desconocida. Un péptido disuelto en el disolvente equivocado a veces puede recuperarse liofilizándolo de nuevo, pero esto cuesta tiempo y material.
Predecir la solubilidad a partir de la secuencia
La solubilidad depende principalmente de la carga neta y de la hidrofobicidad. Para estimar la carga neta a pH neutro, cuente +1 por cada lisina y arginina y por un extremo N-terminal libre, y −1 por cada ácido aspártico y ácido glutámico y por un carboxilo C-terminal libre. La histidina solo está parcialmente cargada cerca del pH neutro. La acetilación elimina la carga positiva N-terminal y la amidación C-terminal elimina la negativa.
Los péptidos con una carga neta claramente positiva son básicos, los que tienen una carga neta claramente negativa son ácidos y los cercanos a cero son neutros. Los péptidos neutros con una proporción alta de residuos hidrofóbicos como Leu, Ile, Val, Phe, Trp y Met son los más difíciles de disolver. El analizador de secuencias informa la carga neta, el punto isoeléctrico y la hidrofobicidad GRAVY, que en conjunto ofrecen una estimación inicial útil. La solubilidad suele ser mínima cerca del punto isoeléctrico.
Elección del disolvente
Comience con el disolvente más suave que probablemente funcione y que sea compatible con el experimento posterior. Una secuencia práctica es probar primero con agua y, si es necesario, ajustar el pH o añadir una pequeña cantidad de codisolvente orgánico.
- Agua estéril: la primera opción por defecto para péptidos cortos, cargados o hidrofílicos. Use agua de alta pureza, estéril y libre de endotoxina cuando la solución vaya a estar en contacto con células.
- Agua bacteriostática: agua estéril que contiene alcohol bencílico como conservante. Limita el crecimiento microbiano en una solución de la que se tomarán muestras repetidamente, pero el alcohol bencílico puede ser citotóxico o interferir con algunos ensayos celulares y bioquímicos, por lo que en el trabajo in vitro suele preferirse agua estéril sola o un tampón.
- Ácido acético diluido: para péptidos básicos que no se disuelven en agua, una pequeña cantidad de ácido acético diluido (comúnmente alrededor del 10 por ciento) protona los grupos residuales y mejora la solubilidad; después, diluya con agua o tampón.
- Hidróxido de amonio o bicarbonato de amonio diluidos: la opción correspondiente para péptidos ácidos; evite las condiciones básicas para secuencias que contienen Cys, que se oxidan más rápido a pH más alto.
- DMSO: para péptidos hidrofóbicos o neutros, disuelva primero en un volumen mínimo de DMSO y luego añada lentamente el tampón acuoso mientras mezcla. Mantenga la concentración final de DMSO lo bastante baja para el ensayo y considere usar DMF en su lugar para péptidos que contienen Met o Cys, ya que el DMSO puede oxidarlos.
Disolución del péptido
Deje que el vial sellado alcance la temperatura ambiente antes de abrirlo, para que la humedad no se condense sobre el polvo frío. Centrifugue brevemente el vial para que todo el polvo se acumule en el fondo. Añada el disolvente por la pared del vial en lugar de directamente sobre el polvo.
Mezcle con suavidad, girando el vial o invirtiéndolo lentamente. La agitación vigorosa en vórtex puede generar espuma, lo que favorece la desnaturalización y la agregación en la interfase aire-agua. Si el material se disuelve lentamente, dejarlo reposar unos minutos o aplicar una breve sonicación en baño de agua puede ayudar, vigilando que no se caliente. Una solución transparente, sin partículas visibles ni turbidez, indica disolución; la turbidez sugiere solubilidad incompleta o agregación, y puede ser necesario otro disolvente.
Para el trabajo con células, filtre de forma esterilizante la solución final a través de una membrana de 0,22 µm de baja unión a proteínas cuando el volumen lo permita, teniendo en cuenta que la filtración elimina los microorganismos pero no la endotoxina; consulte pruebas de endotoxina.
Cálculos de concentración
La concentración de la solución madre es la masa de péptido dividida por el volumen de disolvente. Por ejemplo, 5 mg de polvo disueltos en 2,5 mL dan 2 mg/mL de polvo. Como el polvo también contiene contraiones y agua, multiplique por el contenido neto de péptido para obtener la concentración real de péptido: con un NPC del 80 por ciento, la misma solución contiene 1,6 mg/mL de péptido. Consulte pureza frente a contenido neto de péptido.
Para la concentración molar, divida la concentración en masa en g/L por el peso molecular del péptido libre en g/mol. Un péptido con un peso molecular de 1000 g/mol a 1,6 mg/mL (1,6 g/L) está a 1,6 mM. Para preparar una dilución de trabajo, use C1V1 = C2V2. Estos cálculos, incluida la corrección por NPC, pueden hacerse con la calculadora de laboratorio.
- Concentración en masa = masa de péptido ÷ volumen
- Masa corregida = masa de polvo × contenido neto de péptido
- Molaridad (M) = concentración (g/L) ÷ peso molecular (g/mol)
- Dilución: C1V1 = C2V2
Preparación de alícuotas y almacenamiento
Una vez disuelta, divida la solución madre en alícuotas de un solo uso en tubos de polipropileno de baja unión, de un tamaño tal que cada experimento utilice una alícuota. Rotule cada tubo con el compuesto, el número de lote, la concentración, el disolvente y la fecha. Almacene las alícuotas congeladas a -20 °C o -80 °C y evite volver a congelar las porciones descongeladas.
Las soluciones madre concentradas son en general más estables y pierden proporcionalmente menos material por adsorción a superficies que las soluciones diluidas, por lo que es habitual almacenar una solución madre concentrada y diluirla en el tampón del ensayo el día de uso. Registre el disolvente en las notas experimentales, porque el DMSO, el ácido acético o los conservantes del vehículo deben reproducirse en las condiciones de control de vehículo. Encontrará más orientación en almacenamiento y estabilidad de péptidos.
Preguntas frecuentes
¿Debo usar agua estéril o agua bacteriostática en experimentos in vitro?
Para la mayoría de los experimentos celulares y bioquímicos se prefiere agua estéril libre de endotoxina o un tampón adecuado. El agua bacteriostática contiene alcohol bencílico, que puede afectar la viabilidad celular e interferir con algunos ensayos. Si un conservante es inevitable, debe incluirse a la misma concentración en los controles de vehículo.
Mi péptido no se disuelve en agua. ¿Qué debo probar a continuación?
Estime la carga neta a partir de la secuencia. Para péptidos básicos, añada una pequeña cantidad de ácido acético diluido; para péptidos ácidos, una pequeña cantidad de hidróxido o bicarbonato de amonio diluido. Para péptidos hidrofóbicos o neutros, disuelva en un volumen mínimo de DMSO, o de DMF en el caso de péptidos que contienen Met o Cys, y luego añada lentamente el tampón acuoso.
¿Cómo calculo la concentración de mi solución madre?
Divida la masa de péptido por el volumen de disolvente, después de multiplicar la masa de polvo pesada por el contenido neto de péptido para corregir por los contraiones y el agua. Para la concentración molar, divida el resultado en g/L por el peso molecular del péptido en g/mol. La calculadora de laboratorio realiza estos pasos.
Compuestos mencionados
Cite esta página