HPLC y espectrometría de masas explicadas
La HPLC y la espectrometría de masas son los dos métodos analíticos fundamentales para péptidos. Esta guía explica cómo la HPLC de fase reversa separa los péptidos, cómo la espectrometría de masas ESI y MALDI confirma la identidad y cómo la LC-MS combina ambas.
Por qué se necesitan dos métodos
El control de calidad de péptidos se basa en dos preguntas complementarias: ¿el material es la molécula correcta?, y ¿qué proporción corresponde a esa molécula y no a impurezas relacionadas? La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es eficaz para separar y cuantificar componentes, pero por sí sola no puede decir qué es un pico. La espectrometría de masas (MS) mide la masa molecular con gran exactitud, pero por sí sola no es cuantitativa de forma fiable.
Usadas en conjunto, ofrecen una imagen razonablemente completa. Un certificado de análisis que informa solo uno de los dos deja un vacío importante, y por eso la pureza por HPLC sin identidad por MS figura entre las señales de alerta en cómo leer un COA.
Cómo funciona la HPLC de fase reversa
La mayoría de los métodos de pureza de péptidos utilizan HPLC de fase reversa (RP-HPLC). La columna está rellena de pequeñas partículas de sílice unidas a cadenas hidrofóbicas, con mayor frecuencia C18. La muestra se carga en la columna en un disolvente mayoritariamente acuoso, y la proporción de disolvente orgánico, por lo general acetonitrilo, se aumenta con el tiempo en un gradiente. Los péptidos se unen a la superficie hidrofóbica y eluyen cuando la fase móvil se vuelve lo bastante orgánica como para liberarlos, de modo que los péptidos más hidrofóbicos eluyen más tarde.
Se añade un agente de par iónico, comúnmente ácido trifluoroacético al 0,1 por ciento, a ambas fases móviles para afinar los picos. La detección suele hacerse por absorbancia UV entre 214 y 220 nm, donde absorbe el enlace peptídico, por lo que se detectan casi todas las especies peptídicas. Con frecuencia se usa ácido fórmico en lugar de TFA cuando la HPLC se acopla a MS, porque el TFA suprime la ionización.
- Tiempo de retención: el momento en que eluye un pico; depende del método y no es por sí solo prueba de identidad.
- Área del pico: proporcional a la cantidad de material que absorbe en el UV.
- Pureza por porcentaje de área: área del pico principal dividida por el área total integrada.
- Resolución: qué tan bien se separan los picos vecinos.
Interpretación de un cromatograma
Un buen cromatograma muestra una línea base plana, un pico principal nítido y picos de impurezas pequeños y bien separados. Una tabla de picos indica el tiempo de retención, el área y el porcentaje de área de cada pico. Los hombros en el pico principal o una forma ancha con cola pueden indicar impurezas que coeluyen, agregación o un método poco adecuado. Los detalles del método en el COA, como la columna, el gradiente, el caudal y la longitud de onda, permiten reproducir el resultado.
El porcentaje de área tiene límites. Ignora todo lo que no absorbe a la longitud de onda elegida, incluidos el agua y los contraiones, y supone que las impurezas absorben de forma similar al producto principal. Una ventana de gradiente estrecha puede ocultar impurezas de elución tardía. Por estas razones, los valores de pureza informados con dos decimales y sin descripción del método no tienen sentido. Consulte pureza frente a contenido neto de péptido.
Cómo funciona la espectrometría de masas
La espectrometría de masas convierte las moléculas en iones en fase gaseosa y mide su relación masa/carga (m/z). Dos métodos de ionización predominan en el análisis de péptidos. La ionización por electrospray (ESI) pulveriza una solución a través de una aguja cargada y produce iones con carga múltiple, como [M+2H]2+ y [M+3H]3+. La serie de picos resultante se deconvoluciona para obtener la masa neutra. La ESI se acopla de forma natural con la cromatografía líquida.
La desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI), por lo general con un analizador de tiempo de vuelo (TOF), mezcla la muestra con una matriz que absorbe luz y la ioniza con un pulso láser. MALDI produce sobre todo iones con carga única, como [M+H]+, lo que hace que los espectros sean fáciles de leer. Es rápida y tolerante a las sales, pero en general menos adecuada para una cuantificación precisa.
Masa monoisotópica frente a masa promedio
Los elementos existen como mezclas de isótopos, principalmente carbono-12 y carbono-13. La masa monoisotópica utiliza el isótopo más abundante de cada elemento y corresponde al primer pico del patrón isotópico. La masa promedio se pondera según la abundancia isotópica natural y corresponde al centroide del patrón. En péptidos pequeños la diferencia es inferior a un dalton; en péptidos más grandes aumenta hasta varios daltons, y el pico monoisotópico se vuelve pequeño.
Un COA debe indicar qué valor informa. Las masas monoisotópica y promedio esperadas para cualquier secuencia, incluidas las modificaciones comunes, pueden calcularse con el analizador de secuencias. Las diferencias de masa que corresponden a cambios conocidos ayudan a diagnosticar problemas.
- +16 Da: oxidación, típicamente de metionina o triptófano
- +1 Da: desamidación de Asn o Gln, o un ácido libre en lugar de la amida C-terminal esperada
- −18 Da: pérdida de agua, por ejemplo por formación de aspartimida o piroglutamato
- Masa de un residuo faltante: una secuencia con deleción
- +22 o +38 Da: aductos de sodio o potasio, que son artefactos y no impurezas
Calidad y comparabilidad de los métodos
Un resultado analítico solo es tan bueno como el método que lo respalda. Un método de pureza adecuado utiliza un gradiente lo bastante amplio para eluir todas las impurezas relacionadas, una química de columna apropiada para la hidrofobicidad del péptido y una corrida lo bastante larga para incluir las especies de elución tardía. Muchos laboratorios confirman que un método puede separar productos de degradación conocidos, como formas oxidadas o desamidadas, antes de confiar en él. Una corrida en blanco previa a la muestra muestra qué picos provienen del sistema y no del material.
Los resultados de distintos laboratorios o métodos no son directamente intercambiables. Cambiar la columna, la pendiente del gradiente, la temperatura o la longitud de onda puede modificar la pureza aparente en varios puntos porcentuales. En estudios prolongados, mantener el mismo método, o al menos analizar un lote de referencia retenido junto con el material nuevo, hace que las comparaciones sean más fiables. En cuanto a la espectrometría de masas, los instrumentos deben calibrarse con patrones conocidos, y la exactitud informada debe ser coherente con la clase de instrumento. Estos detalles rara vez se imprimen completos en un COA, pero un laboratorio reputado puede proporcionarlos si se le solicitan.
LC-MS y otras técnicas
La LC-MS combina ambos métodos: la HPLC separa los componentes y el espectrómetro de masas identifica cada uno a medida que eluye. Esto permite asignar los picos de impurezas, por ejemplo mostrando que un pico pequeño anterior al producto principal es una secuencia con deleción. La MS en tándem (MS/MS) fragmenta iones seleccionados para obtener información de secuencia, lo que ayuda a confirmar que los residuos están en el orden correcto.
Otros métodos cubren vacíos específicos. El análisis de aminoácidos o el análisis de nitrógeno miden el contenido neto de péptido. La cromatografía iónica o la RMN de 19F pueden cuantificar el TFA residual. Los métodos quirales detectan impurezas de D-aminoácidos producidas por racemización, que tienen la misma masa que el producto deseado y pueden coeluir en una HPLC estándar.
Preguntas frecuentes
¿Puede la HPLC por sí sola confirmar la identidad de un péptido?
No. Un tiempo de retención que coincide con el de un patrón de referencia analizado en condiciones idénticas es evidencia de apoyo, pero distintas moléculas pueden eluir en tiempos similares. Se necesita espectrometría de masas para confirmar que el pico principal tiene la masa molecular esperada. El orden de la secuencia puede confirmarse además mediante MS en tándem.
¿Por qué un espectro ESI muestra varios picos para un mismo péptido?
El electrospray produce iones que portan distinto número de protones, como 2+, 3+ y 4+. Cada estado de carga aparece a un valor de m/z diferente. El software deconvoluciona la serie a una única masa neutra, que debe coincidir con la masa teórica de la secuencia.
¿Qué diferencia entre la masa observada y la teórica es aceptable?
Depende del instrumento. Los instrumentos de alta resolución suelen coincidir dentro de unas pocas partes por millón, mientras que los de menor resolución pueden tener una exactitud de solo una fracción de dalton o más en péptidos grandes. Lo esencial es que el COA indique el tipo de valor y que cualquier diferencia no corresponda a una modificación conocida o a un residuo faltante.
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