Filtración esterilizante de soluciones de péptidos
La filtración esterilizante a través de membranas de 0,22 µm elimina las bacterias de las soluciones de péptidos para el trabajo in vitro. Esta guía aborda las clasificaciones de tamaño de poro, los materiales de membrana como PES y PVDF, las pérdidas por adsorción, lo que la filtración no elimina y las buenas prácticas de laboratorio.
Qué hace la filtración esterilizante
La filtración esterilizante hace pasar una solución a través de una membrana con poros lo bastante pequeños como para retener las bacterias. Se utiliza con las soluciones de péptidos porque la esterilización por calor dañaría la mayoría de ellos. En el laboratorio es un paso estándar al preparar soluciones madre para cultivo celular u otros experimentos en los que el crecimiento microbiano comprometería los resultados.
La filtración es una parte de la manipulación aséptica y no una garantía por sí sola. El filtro, la carcasa, la jeringa y el recipiente receptor deben ser estériles, el trabajo debe realizarse en un entorno limpio como una cabina de bioseguridad, y la solución filtrada debe mantenerse cerrada y manipularse de forma aséptica después. Los pasos para preparar la solución madre en primer lugar se tratan en reconstitución para uso en laboratorio.
Clasificaciones de tamaño de poro
Las membranas clasificadas en 0,22 µm o 0,2 µm son el estándar para la filtración de grado esterilizante. La clasificación no es un tamaño literal de los orificios, sino una declaración de rendimiento, validada convencionalmente desafiando la membrana con una concentración alta de la pequeña bacteria Brevundimonas diminuta y demostrando que ninguna la atraviesa. Los fabricantes usan ambas cifras de forma prácticamente intercambiable.
Los tamaños de poro mayores, como 0,45 µm, se utilizan para clarificación y eliminación de partículas, pero no son de grado esterilizante. Las clasificaciones menores, de alrededor de 0,1 µm, se utilizan cuando preocupa la retención de micoplasmas. Los prefiltros con poros más grandes pueden proteger un filtro esterilizante de la obstrucción cuando las soluciones contienen partículas o agregados.
En aplicaciones críticas, la integridad de un filtro esterilizante puede confirmarse después de su uso con pruebas como la prueba del punto de burbuja, que mide la presión necesaria para hacer pasar gas a través de una membrana humedecida. Los filtros de jeringa de un solo uso de los laboratorios de investigación rutinarios rara vez se someten a esta prueba, lo que hace aún más importante elegir un producto certificado y de confianza y evitar una presión excesiva durante la filtración. Un filtro que se rompe o tiene fugas en el sello de la carcasa ya no esteriliza la solución.
Materiales de membrana
El polímero de la membrana determina cuánto péptido se adhiere al filtro, qué disolventes tolera y cuánto material puede liberar en el filtrado. Para los péptidos se prefieren las membranas de baja unión a proteínas.
- PES (polietersulfona): hidrofílica, de baja unión a proteínas y flujo rápido; una opción por defecto común para soluciones acuosas de péptidos y medios de cultivo celular.
- PVDF (fluoruro de polivinilideno), grado hidrofílico: unión a proteínas muy baja y amplia compatibilidad química; también muy utilizada para péptidos.
- Acetato de celulosa: baja unión, adecuada para soluciones acuosas; tolerancia limitada a los disolventes.
- Nailon: resistente y tolerante a los disolventes, pero tiende a unir proteínas y péptidos con más fuerza; en general se evita en el trabajo con péptidos diluidos.
- PTFE: hidrofóbico por naturaleza y adecuado para disolventes orgánicos como el DMSO o para la ventilación; existen grados de PTFE hidrofílico para uso acuoso.
- Ésteres mixtos de celulosa y nitrocelulosa: unión alta; no se recomiendan para péptidos.
Pérdidas por adsorción
Todo filtro tiene una gran superficie interna, y parte del péptido se adsorbe en ella, sobre todo en la primera porción de solución que lo atraviesa. La pérdida es fija en términos absolutos para un filtro y un péptido determinados, por lo que se vuelve proporcionalmente importante en soluciones diluidas o volúmenes pequeños. Los péptidos hidrofóbicos, anfipáticos y catiónicos, incluidos los péptidos antimicrobianos como LL-37, tienden a unirse más que los péptidos cortos e hidrofílicos.
Varias prácticas reducen el impacto. Filtre a mayor concentración y diluya después con un diluyente estéril. Elija un filtro con la menor superficie de membrana adecuada al volumen, ya que los filtros de jeringa se fabrican en varios diámetros. Algunos laboratorios humedecen previamente el filtro con tampón o desechan la primera porción del filtrado. Cuando la exactitud de la concentración importa, mida la concentración antes y después de la filtración, por ejemplo por absorbancia UV en péptidos que contienen Trp o Tyr; consulte métodos de cuantificación de péptidos.
Lo que la filtración no elimina
Un filtro de 0,22 µm elimina bacterias y hongos, pero no las moléculas disueltas. La endotoxina, el lipopolisacárido de las bacterias gramnegativas, lo atraviesa porque sus moléculas y sus agregados pequeños son mucho más pequeños que la clasificación de poro. El control de la endotoxina depende de partir de material con baja endotoxina y de preparar las soluciones con agua y material de laboratorio libres de endotoxina; consulte pruebas de endotoxina.
Los virus, la mayoría de los micoplasmas en algunas condiciones y los contaminantes químicos también atraviesan los filtros esterilizantes estándar. La filtración no revierte la degradación química ni elimina los agregados solubles pequeños. Los agregados grandes quedarán retenidos, lo que los elimina de la solución pero también reduce la concentración de péptido, por lo que la filtración de una solución turbia debe ir seguida de una nueva cuantificación; consulte agregación de péptidos.
Compatibilidad con disolventes y extraíbles
Los filtros deben ser compatibles con el disolvente. Los tampones acuosos son adecuados para la mayoría de las membranas hidrofílicas, mientras que las soluciones madre en DMSO u otros disolventes orgánicos requieren membranas y carcasas aptas para ellos, a menudo PTFE o ciertos grados de nailon o PVDF. Usar un filtro incompatible puede dañar la membrana, comprometiendo la esterilidad, o disolver material de la carcasa en el filtrado.
Los filtros también pueden liberar extraíbles, como agentes humectantes o fragmentos de polímero, que pueden tener importancia en trabajos analíticos o celulares sensibles. Enjuagar con un pequeño volumen de disolvente antes de filtrar la muestra y elegir filtros destinados a la aplicación reducen este riesgo. Las tablas de compatibilidad de los fabricantes son la referencia para combinaciones específicas de disolvente y membrana.
El pH y los aditivos también importan. Las soluciones madre fuertemente ácidas o básicas, las concentraciones altas de agentes caotrópicos y algunos detergentes pueden afectar las membranas o cambiar la cantidad de péptido que se une. Cuando un péptido debe disolverse en un codisolvente orgánico y luego diluirse, a menudo es más sencillo filtrar la dilución acuosa final a través de una membrana estándar de baja unión, siempre que el péptido permanezca en solución en esa etapa.
Secuencia práctica
A continuación se describe una secuencia típica para una solución madre acuosa de péptido destinada a cultivo celular. Los mismos principios se aplican a otros usos in vitro.
- Prepare la solución madre con disolvente estéril y libre de endotoxina en un entorno limpio.
- Seleccione un filtro estéril de 0,22 µm de baja unión, de tamaño y compatibilidad con el disolvente adecuados.
- Filtre en un tubo receptor estéril de baja unión, sin forzar con una presión excesiva.
- Opcionalmente, mida la concentración tras la filtración para tener en cuenta la adsorción.
- Divida en alícuotas en tubos estériles de un solo uso y rotúlelos con el compuesto, el lote, la concentración, el disolvente y la fecha.
- Almacene las alícuotas congeladas y evite los ciclos repetidos de congelación y descongelación; consulte almacenamiento y estabilidad de péptidos.
Preguntas frecuentes
¿Un filtro de 0,22 µm elimina la endotoxina?
No. Las moléculas de endotoxina y sus agregados pequeños son mucho más pequeños que la clasificación del filtro y lo atraviesan. La filtración esterilizante elimina las bacterias, pero no la endotoxina que estas dejan. El control de la endotoxina depende de partir de un péptido con baja endotoxina, de disolventes y material de laboratorio libres de endotoxina, y de analizarla cuando importa.
¿Qué membrana de filtro es la mejor para péptidos?
Las membranas hidrofílicas de baja unión a proteínas, como la PES o el PVDF hidrofílico, son opciones comunes para soluciones acuosas de péptidos. Las membranas de nailon y de ésteres mixtos de celulosa tienden a unir los péptidos con más fuerza. Para disolventes orgánicos como el DMSO se necesita una membrana compatible, como el PTFE. La mejor opción también depende del volumen y de las propiedades del péptido.
¿Cuánto péptido se pierde durante la filtración?
Depende del péptido, la membrana, el tamaño del filtro y la concentración. Las pérdidas corresponden en gran medida a una cantidad fija unida a la superficie de la membrana, por lo que importan sobre todo en soluciones diluidas y volúmenes pequeños. Filtrar a mayor concentración, elegir filtros pequeños de baja unión y medir la concentración antes y después de la filtración ayudan a cuantificar y limitar la pérdida.
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